PCR儀專題
PCR儀主要適用于醫學、司法科學、生物技術、分子生物學、環境科學、臨床診斷、流行病學、遺傳學、基因檢測等領域。PCR儀可分為梯度PCR儀、原位PCR儀、實時熒光定量PCR儀、普通PCR儀。下面將為您詳細介紹PCR儀：
一、PCR儀分類
1.梯度PCR儀：是由普通PCR儀衍生出的帶梯度PCR功能的基因擴增儀。PCR反應能否成功，退火溫度是關鍵，梯度PCR儀每個孔的溫度可以在指定范圍內按照梯度設置，根據結果，一步就可以摸索出[much]適反應條件。
2.原位PCR儀：可用于從細胞內靶DNA的定位分析的細胞內基因擴增儀，可保持細胞組織的完整性，使PCR反應體系滲透到組織和細胞中，在細胞的靶DNA所在的位置上進行基因擴增。
3.實時熒光定量PCR儀：它的的發明實現了榮獲諾貝爾化學獎的PCR核酸檢測、分子診斷的技術飛躍。是在普通PCR儀的基礎上增加一個熒光信號采集系統和計算機分析處理系統，就成了熒光定量PCR儀。
4.普通PCR儀：可應用于科研研究，教學，醫學臨床，檢驗檢疫等機構，對目的基因退火溫度的擴增。
二、PCR技術的應用舉例
1.研究：基因克隆;DNA測序;分析突變;基因重組與融合;鑒定與調控蛋白質結合DNA序列;轉座子插入位點的繪圖;檢測基因的修飾;合成基因的構建;構建克隆 或表達載體;檢測某基因的內切酶多態性。
2.免疫學：HLA分裂;T細胞受體或抗體多樣化的定性;自身免疫病基因作圖;淋巴因子定量
人類基因組工程：用散布重復序列產生DNA標志;遺傳圖譜的構建(檢測DNA、 多態性或精子繪圖);物理圖譜的構建;測序，表達圖譜。
3.診斷：細菌(螺旋體、支原體、衣原體、分支桿菌、立克次氏體、白喉桿菌、致病大腸桿菌、痢疾桿菌、嗜水氣單胞菌和艱難梭菌等);病毒(HTLV、HIV、 HBV、 HPVS、EV、CMV、EBV、HSV，麻疹病毒、輪狀病毒、細小病毒B19);寄生蟲(瘧疾 等);人遺傳病(Lesh-Nyhan綜合癥、地貧、血友病、BMD、DMD、囊性纖維化等)。
4.法醫：犯罪現場標本分析;HLA-DQ。
5.腫瘤：胰癌、結腸癌、肺癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、血液惡性腫瘤。
6.組織和群體生物學：遺傳聚類研究;動物保護研究;生態學;環境科學;實驗遺 傳學古生物學：考古與博物館標本分析。
7.動物學：動物傳染病的診斷等
8.植物學：檢測植物病原等
三、PCR儀使用說明：
（一）試劑PCR儀
1.引物：決定擴增的特異性。根據檢測的DNA不同，選用不同引物，每種病原微生物都有自己特異的引物。
2.耐熱的DNA聚合酶：此酶是從耐熱細菌中分離出來的，能耐受高溫90℃-100℃。
3.10×PCR緩沖液：500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl（pH8.4,20℃）150mmol/L MgCl2,1mg/ml明膠。10×PCR緩沖液隨酶一起購買。
4.5mmol/L dNTP貯備液：將dATP、dCTP、dGTP和dTTP鈉鹽各100mg合并，加入滅菌去離子水溶解，用NaOH調pH至中性，分裝每份300μl，-20℃保存。dNTP濃度理想地用UV吸收法[accurate測定。現用dNTP溶液均有商品化產品。
5.DNA模板：用處理液將待測標本處理，不同處理方法、操作各異，但目的是暴露標本中被檢測的DNA。
（二）操作程序PCR儀
過去標準的PCR操作程序是將PCR儀必需反應成份分別加入一微量離心管中，然后置于一定的循環參數條件下進行循環擴增。具體如下：
1.向一微量離心管中依次加入
DNA模板 102-105拷貝
引物 各1μmol/L
dNTP 各200μmol/L
10×PCR緩沖液 1/10體積
ddH2O 補到終體積（終體積50μl-100μl）
混勻后，離心15s使反應成分集于管底。以上步驟僅在實驗研究用，現在商品化試劑已將dNTP、10×PCR緩沖液，引物，ddH2O混合在一起，反應體積為20-25μl，只要試驗人員加入處理好的樣品就可以了。
2.加石蠟油50-100μl于反應液表面以防蒸發。置反應管于97℃變性10min。
3.冷至延伸溫度時，加入1-5u Taq DNA聚合酶，離心30s使酶和反應液充分混合。現在臨床使用試劑酶通常已加入反應液中。
4.PCR儀的循環程序為：94℃變性30s，55℃退火20s，然后在72℃延伸30s，共循環30-35次。[much]后一次循環結束后，再將反應管置72℃溫育5min，以確保充分延伸。
PCR儀尚可用于組織標本DNA的擴增。由于固定組織標本的DNA常發生降解，就給常用的分析方法如Southern轉印雜交等帶來一定困難。
在應用PCR方法檢測RNA病毒時，首先應將RNA轉化成cDNA才能進行擴增，因為PCR只能對DNA模板進行擴增，我們把這種RNA的PCR反應稱為反轉錄PCR，簡稱RT-PCR。把由RNA轉化成DNA的過程叫做反轉錄，反轉錄需要在反轉錄酶的作用下完成。
四、PCR儀詳細操作步驟：
1、開機：打開開關，視窗上顯示“SELF TEST”，顯示10秒中后，顯示RUN-ENTER菜單： “-RUNENTER PROGRAM PROGRAM ”準備執行程序。
2、放入樣本管，關緊蓋子。
3、如果要運行已經編好的程序，則直接按《Proceed》，用箭頭鍵選擇已儲存的程序，按《Proceed》，則屏幕顯示：“- ENABLE DISABLE HEATED LID” 按《Proceed》選擇ENABLE，則開始執行程序。
4、如果要輸入新的程序，則在RUN-ENTER菜單上用箭頭鍵選擇ENTER PROGRAM，按《Proceed》，屏幕顯示 “ -NEWLIST EDITDELET”，按《Proceed》
1）選擇NEW，命名新的程序，[much]多8個字母，輸入后按《Proceed》確認。
2）輸入程序步驟：名字輸入后，顯示“ STEP1 _TEMP GOTO OPITON END”，按《Proceed》則可以輸入溫度（0～100℃），按《Proceed》確認后，則可以輸入孵育時間，用《Select》鍵移動光標，輸入數字，完成后按《Proceed》確認，跳到下一步，輸入方式同上。
3）選擇GOTO，輸入循環步驟時鏈接到第幾步（循環數[much]多可達9999次）（為實際循環數-1)。
4) 選擇option，顯示“ STEP EXTENDI NCREMENT SLOPE ”再選擇increment，按《Proceed》確認，輸入初始的溫度，確認后輸入時間，按《Proceed》確認，然后輸入每個循環增加或減少的溫度，增加用正值，減少用負值（-0.1℃～6℃），按《Proceed》確認。選擇extend，按《Proceed》確認，輸入每個循環增加或減少的時間（-60～60秒），按《Proceed》確認。
選擇slop（指溫度上升或下降的速率），輸入溫度的改變值（-0.1～1.5℃）按《Proceed》確認，然后輸入加熱或致冷的速度，按《Proceed》確認。
4）選擇End，輸入結束步驟。
5、輸入完成的程序后，到RUN-ENTER菜單，選擇新程序，開始運行。
6、其它：用《pause》可以暫停一個運行的程序，再按一次繼續程序。用《stop》或《Cancel》可停止運行的程序。
五、PCR儀使用注意事項：
1. PCR儀應放置在水平堅固的平臺上，外界電源系統電壓要匹配，并要求有良好的接地線。
2.環境溫度保持在23℃左右，濕度保持在60％左右。
3.應配備功率≥3000W的穩壓器。
4.應定期清潔維護。
5.使用時應嚴格遵守上述使用步驟。
六、PCR儀維護保養方法：
1.樣品槽應每月定期進行清理（在樣品槽中加入少量95％乙醇，用棉簽擦洗反應孔，用干棉簽吸干乙醇）。
2.每月應定期對熱蓋進行清潔。
3.校正ROI光路以便確信結果仍然是優化的。
4.每月檢查樣品槽的熒光污染，如有需要隨時進行。
七、PCR儀常見故障處理方法：
1.使用PCR管，反應后部分PCR管內反應液有明顯蒸發
解決方法：a.確保使用高質量的PCR管或使用我們推薦的PCR管
b.在樣品臺的四角放置四個同樣的空PCR管，以保證熱蓋壓在各PCR管上的壓力均勻
2. 使用的微孔板，反應后反應液有明顯蒸發
a.確保使用高質量的微孔板，反應前要嚴格密封
b.確保蓋緊熱蓋，適當提高熱蓋的溫度
c.增大反應體積
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